LacZ is een bacterieel gen dat het enzym beta - galactosidase , dat van lactose in glucose en galactose breekt produceert . Het enzym splitst eveneens de verbinding X - gal , dat een blauwe kleur die moleculair biologen als merker of reporter op de aanwezigheid van het LacZ -gen in cellen sporen produceert . Transfectie
Wetenschappers
verbinden de LacZ -gen met een gen van belang , zoals insuline , een fragment van genoemd DNA een plasmide . Zij maken gebruik van chemische of elektrische transfectie methoden om het plasmide in cellen te krijgen . De cellen worden getest op LacZ expressie van beta - galactosidase , waarbij ook de aanwezigheid van de insuline gen zal markeren .
Fixatie
Na transfectie worden de cellen gekweekt op een plastic petrischaal . Voor de assay wordt het kweekmedium verwijderd en cellen worden gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing ( PBS ) . Een verse fixatie oplossing van formaldehyde , methanol en glutaaraldehyde wordt gebruikt om de cellen herstellen gedurende twee minuten . De fixatief wordt verwijderd en de cellen worden opnieuw gewassen met PBS .
X - gal
Een frisse kleuroplossing dat X - gal bevat , kalium ferri - cyanide en kalium ferro - cyanide wordt toegevoegd aan de cellen gedurende de nacht . De cellen worden opnieuw gewassen met PBS , en als de LacZ gen aanwezig is , zal het beta - galactosidase het X - gal zijn gesplitst en de cellen blauw zijn .
|
